Western免疫印跡(WesternBlot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。
 

　　Western Blot 免疫印跡法樣品制備主要步驟：
 

　　原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為 定性檢測目的蛋白時細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。
 

　　1、培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。
 

　　2、棄培養(yǎng)基，用1X PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。
 

　　3、加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。
 

　　4、超聲 10~15秒剪切DNA以減低樣品粘性。
 

　　5、煮沸樣品5 minutes。
 

　　6、離心12000g，5 min，取上清。
 

　　7、電泳分離：上樣15μl~20μl 至 SDS-PAGE 膠 (10 cm x 10 cm)電泳。 如要定量檢測某蛋白的表達(dá)水平， 應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask)裂解細(xì)胞， 收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15min，14000g離心15min(4℃)，棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測定方法測定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。
 

　　注意：一般上樣20~30 μg已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量 至100μg，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測方法。
 

　　注意事項：
 

　　1、操作中戴手套，不要用手觸膜。
 

　　2、PVDF膜在甲醇中浸泡時間不要超過5秒。
 

　　3、如檢測小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2μm的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時的平衡步驟。
 

　　4、某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時可用1.0% BSA代替Tween-20。
 

　　5、關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。
 

　　6、如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測后可進(jìn)行蛋白染色。
 

　　7、如要同時檢測大分子量和小分子蛋白，*用梯度膠分離蛋白。